Введение
В результате многолетних исследований НММ-мутагенеза подсолнечника, в нашей лаборатории были выявлены некоторые закономерности индукции хлорофильных мутаций, различной генетической природы. Установлено, что НММ в концентрациях 0,01% и 0,015% эффективно индуцирует внеядерные хлорофильные мутации (Усатов и др., 1995). Повышение концентрации до 0,02% приводит к индукции не только пластидных, но и ядерных хлорофильных мутаций (Белецкий, 1989). Мутаген в концентрации 0,03% вызывает крупные структурные перестройки ядерного генетического материала, которые регистрируются как аберрации хромосом (Гуськов и др., 2001).
В настоящее время в Южном федеральном университете создана уникальная коллекция хлорофильных мутантов подсолнечника (Усатов и др., 2004; Усатов и др., 2010). Уникальность коллекции заключается в том, что хлорофильные мутации, различной генетической природы выделены после обработки в различных режимах N-нитрозо-N-метилмочевиной (НММ) семян или проростков одной инбредной линии. В данном сообщении приведен физиолого-генетический анализ коллекционных линий внеядерных пестролистных химеры variegated, растений которых в течение нескольких десятилетий наследуют с различной степенью выраженности хлорофильные дефекты.
Материалы и методы
Объектом исследований служили внеядерные мутанты коллекционных линий пестролистных химер variegated (var), список которых приведен в конце статьи. Мутантные формы были выделены после обработки в различных режимах N-нитрозо-N-метилмочевиной (НММ) подсолнечника линии 3629. Семена линии 3629 были любезно предоставлены нам А. И. Гундаевым в 1966 г. (получена автором из среднеспелой высокомасличной популяции подсолнечника ВНИИМК № 20044 в 1959 г.).
Растения выращивали на полях учебно-опытного хозяйства ЮФУ (п. Недвиговка). Почва — обыкновенный чернозем южно-европейской фации. Для выяснения генетической природы хлорофильных мутаций проводили реципрокные скрещивания мутантов с зелеными растениями линии 3629. Изучали F1 — F3 поколения. Методика проведения реципрокных скрещиваний общепринятая. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в мутантных и зеленых тканях листьев пестролистных растений определяли методом (Гавриленко и др., 1975). В промерах в каждом варианте использовали не менее 20 растений. Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента (Бейли, 1973).
Результаты и их обсуждение
Фенотипически пестролистные формы подсолнечника мутантных линий var, в отличие от зеленых растений исходной линии 3629 (рис. 1), характеризуются наличием на листьях белых, желтых или желто-зеленых участков самых различных размеров и форм (рис. 2, 3).
Рисунок 1 — Растение инбредной линии 3629
Рисунок 2 — Внеядерная хлорофильная химера variegated 11
Рисунок 3 — Внеядерная хлорофильная химера variegated 10
Иногда пестролистность у этого типа мутантов можно наблюдать уже на стадии семядолей, но чаще у первых и последующих настоящих листьев, где она сохраняется до их естественного отмирания, при этом граница между измененной и нормальной зеленой тканью листа четко выражена.
В таблице 1 приведены результаты расщепления в потомстве после самоопылении пестролистных растений мутантных линий var. Видно, что пестролистные растения всех изучаемых линий расщепляются в потомстве на три типа проростков: зелёные, пёстрые и летальные (белые или желтые). Последние погибают на стадии развития первой пары настоящих листьев.
Таблица 1 — Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий var
Линия |
Количество растений в потомстве |
Количество мутантных растений, % |
||
зеленых |
пестрых |
белых, жёлтых |
||
Var - 1 |
27 |
8 |
5 |
32,5 |
Var – 2 |
24 |
14 |
9 |
51,0 |
Var – 3 |
30 |
4 |
0 |
11,8 |
Var – 4 |
19 |
17 |
7 |
55,8 |
Var – 6 |
17 |
5 |
4 |
36,0 |
Var – 7 |
24 |
7 |
0 |
29,2 |
Var – 8 |
18 |
10 |
1 |
37,9 |
Var – 9 |
25 |
6 |
8 |
35,9 |
Var – 10 |
69 |
6 |
14 |
22,5 |
Var – 11 |
32 |
40 |
25 |
67,0 |
Var – 12 |
23 |
26 |
42 |
74,2 |
Var – 13 |
14 |
4 |
0 |
28,6 |
Var – 14 |
56 |
29 |
8 |
39,8 |
Var – 15 |
14 |
12 |
8 |
58,8 |
Var – 17 |
33 |
4 |
9 |
28,3 |
Var – 20 |
33 |
6 |
3 |
21,4 |
Var – 23 |
25 |
14 |
12 |
51,0 |
Var – 24 |
10 |
10 |
8 |
64,3 |
Var – 25 |
32 |
27 |
13 |
55,6 |
Var – 27 |
16 |
12 |
5 |
51,5 |
Var – 28 |
22 |
8 |
4 |
35,3 |
Var – 29 |
11 |
13 |
5 |
62,1 |
Var – 30 |
29 |
6 |
0 |
20,7 |
Var – 32 |
54 |
6 |
6 |
18,2 |
Var – 33 |
22 |
10 |
8 |
45,0 |
Var – 35 |
9 |
12 |
5 |
65,4 |
∑ |
688 |
316 |
209 |
|
% |
57, 8% |
42,2 % |
|
Хотя числовые отношения при расщеплении непостоянны, однако они носят устойчивый, регулярно повторяющийся (на протяжении более 45 лет) характер, подтверждая генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений (табл. 2).
Таблица 2 — Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий var после самоопыления
Год наблюде-ния |
Количество изученных семей |
Количество растений в потомстве |
Количество мутантных растений, % |
||
зеленых |
пестрых |
белых (желтых) |
|||
1967 |
50 |
432 |
199 |
88 |
39,9 |
1968 |
60 |
1128 |
536 |
491 |
47,7 |
1969 |
53 |
1404 |
584 |
537 |
44,4 |
1970 |
59 |
1126 |
457 |
310 |
40,5 |
1972 |
69 |
1006 |
385 |
347 |
42,1 |
1973 |
61 |
1145 |
325 |
268 |
34,1 |
1974 |
72 |
1154 |
428 |
259 |
37,3 |
1976 |
51 |
1404 |
431 |
778 |
46,3 |
1977 |
66 |
927 |
261 |
772 |
52,6 |
2000* |
15 |
556 |
267 |
192 |
45,2 |
2001* |
15 |
547 |
227 |
162 |
41,6 |
2003* |
15 |
461 |
283 |
126 |
47,1 |
2004* |
15 |
395 |
201 |
179 |
49,0 |
2011* |
15 |
457 |
183 |
158 |
42,7 |
2012* |
15 |
411 |
137 |
117 |
38,2 |
Примечание: * — приведены результаты только по тем линиям пестролистных химер, которые были выделены в 1967 году.
Безусловно, возникновение пестролистности еще не является свидетельством пластидной природы этого признака. В основе появления бесхлорофилльных секторов на зеленом растении могут лежать различные причины (Белецкий 1989).
Для доказательства однородительского материнского наследования мутантного признака были проведены реципрокные скрещивания пестролистных форм с растениями исходной линии 3629. В том случае, когда пестролистные растения опыляли пыльцой зеленых растений, гибридное потомство расщеплялось в F1 как и при самоопылении (табл. 1). При обратном направлении скрещивания, то есть когда в качестве материнского растения использовали зеленое, а отцовским растением служила пестролистная форма, все потомство было зеленым и не расщеплялось в последующих поколениях (табл. 1.4). Следует отметить, что константными остается и потомство зеленых растений, возникающих в потомстве пестролистных химер.
Таблица 3 — Расщепление в потомстве реципрокных гибридов, полученных в результате скрещиваний пестролистных форм с растениями исходной линии 3629
Год опытов |
Направление скрещивания |
Кол-во растений в F1 |
Кол-во мутантных растений, % |
||
зеленых |
пестрых |
белых (желтых) |
|||
2011 |
пестрое х зеленое |
273 |
132 |
92 |
45,1 |
зеленое х пестрое |
369 |
0 |
0 |
0 |
|
2012 |
пестрое х зеленое |
211 |
89 |
66 |
42,4 |
зеленое х пестрое |
147 |
0 |
0 |
0 |
Имитацию материнской наследственности можно наблюдать при апомиксисе. Поскольку апомиксис иногда встречается у подсолнечника (Хохлов, 1967), был поставлен эксперимент по определению возможности к апомиктическому способу размножения растений исходной материнской линии и пестролистных форм. Для этого у цветков 20 зеленых растений 3629 и 40 пестролистных растений из различных линий var удаляли тычинки, и затем растения инцухтировали. Было обнаружено, что как у растений исходной линии, так и у пестролистных мутантов только в единичных случаях апомиктично может образовываться незначительное количество плодов (не более 1–2 штук на корзинку).
Поскольку фенотипически мутантные растения отличаются от исходных зеленых, прежде всего окраской листьев (от белой до желто-зеленой), было проведено сравнительное исследование содержания хлорофиллов и каротиноидов. Визуально по окраске мутантной ткани пестролистные формы можно разбить на 3 группы (табл. 4). Зеленые растения с белыми участками содержат в белых секторах фактически следы хлорофиллов (0,2–3,0% от контроля) и каротиноидов (8–10% от контроля). Чуть больше пигментов у растений с желтыми секторами (содержание хлорофиллов в желтых секторах до 9%, каротиноидов — до 41% от контроля). В растениях с желто-зелеными пятнами содержание зеленых пигментов и каротиноидов в мутантной ткани достигает 36,7% и 87,6% от контроля соответственно. Зеленые участки по содержанию хлорофиллов приближаются к контрольным показателям или даже превышают их. Мы предполагаем, что поскольку мутантная ткань фотосинтетически не активна и поддерживается за счет зеленой части, снабжающей ее продуктами фотосинтеза, функциональная активность последней может повышаться, что мы часто, и наблюдаем в зеленых тканях пестролистных растений.
Таблица 4 — Содержание хлорофиллов, а+b и каротиноидов в листовой ткани пестролистных растений подсолнечника в фазу бутонизации
Линия |
Фенотип ткани |
Содержание, мг/г абсолютно сухого веса |
|||
Хлорофиллы a+b |
Каротиноиды |
||||
абс. |
% от контр. |
абс. |
% от контр. |
||
3629 |
зеленый |
7,9±0,5 |
100 |
2,17±0,7 |
100 |
Var 9, 10, 17, 32 |
зеленый |
7,60-8,80 |
96,2-111,3 |
2,01-3,12 |
92,6-143,8 |
белый |
0,02-0,24 |
0,2-3,0 |
0,14-0,20 |
6,5-9,2 |
|
Var 1, 2, 4, 6, 7, 11, 13, 14, 15, 20, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 33, 35 |
желтый |
0,19-0,74 |
2,4-9,4 |
0,45-0,86 |
20,7-39,6 |
Var 3, 8, 12, 24 |
желто-зеленый |
1,10-2,90 |
14,0-36,7 |
0,95-1,90 |
43,8-87,6 |
Для пластид в мутантных тканях характерны глубокие изменения ультраструктуры. Это, прежде всего частичное или полное отсутствие тилакоидной системы в жёлтых и белых участках соответственно, а также изменение размеров и числа пластоглобул (Усатов и др. 2004). Отмеченные изменения ультраструктуры пластид, очевидно, связаны с ингибированием процесса образования ламеллярной системы в жёлто-белых секторах. Эти изменения коррелируют с вышеприведёнными данными по содержанию пигментов. О наличии тесной связи между развитостью тилакоидной системы и содержанием пигментов известно из ранних работ других исследователей (Уоддингтон, 1964).
Тест на соматическое расщепление потомства ещё со времён Э. Баура и К. Корренса является одним из чётких критериев пластомной обусловленности дефекта пластид. У высших растений этот тест широко применяется для анализа пластомно обусловленной пестролистности (Давыденко, 1984). Тест основан на явлении сортировки мутантных и нормальных наследственных цитоплазматических детерминант или несущих их органелл. Ядерные гены, расположенные в хромосомах, передаются в митозах потомству всех клеток в равной мере, и все клетки организма обладают равными наследственными потенциями по этим генам. Цитоплазматические же гены по причине множественности копий, в которых они представлены, и отсутствия механизма, аналогичного митозу, для точного удвоения и распределения нормальных и мутантных органелл могут распределяться между дочерними клетками асимметрично. Вследствие этого различные части растений могут быть гетерогенными по цитоплазматическим генам и содержать два их типа (нормальный и мутантный) в разных пропорциях.
В результате электронно-микроскопическго анализа листьев пестролистных растений различных линий var на границе между зеленой и мутантной тканями были обнаружены гетеропластидные клетки (Усатов и др. 2004).
Таким образом, на основании приведенных результатов (постоянное соматическое расщепление, однородительское материнское наследование мутантного признака, изменения внутренней структуры пластид, наличие на границе между нормальными и мутантными тканями гетеропластидных клеток) нами сделан вывод о пластидной природе мутаций у внеядерных пестролистных форм подсолнечника.
В заключении следует отметить, что в результате многолетних наблюдений нами были проанализированы сотни линий внеядерных пестролистных химер подсолнечника, но ни в одной из них не произошло полной рассортировки мутантных и нормальных (зеленых) пластид. Более того, анализ временной динамики возникновения мутантных растений в потомстве пестролистных форм (табл. 2), позволяет заключить, что расщепление пестролистных химер носит устойчивый, регулярно повторяющийся (для 15 линий var, на протяжении более 45 лет) характер, демонстрируя генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений. Следовательно, после однократной обработки семени мутагеном (НММ), мутантные пластиды, сохраняя свою индивидуальность, при прохождении через тысячи делений в соматических клетках и цитоплазматический мейотический отбор, воспроизводятся в последующих поколениях. Это свидетельствует о возможности адаптивного пути цитоплазматической эволюции, основанной на поддержании в поколениях гетерогенности генетического материала клеточных органелл.
Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).
Каталог хлорофильных мутантов подсолнечника I. Пестролистные формы (Variegated)
Мутантная линия, год получения |
Условия обработки мутагеном |
Генетическая природа мутации, ее фенотипическое выражение |
Variegated-1 1967 |
0,01 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 24 ч при 220 С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-2 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-1 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-3 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-1 |
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-4 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-1 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-6 1967 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 24 ч при 220 С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-7 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-8 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-9 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с белыми и светло-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-10 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с белыми и светло-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-11 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-12 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеными обесцвечивающимися секторами на листьях. |
Variegated-13 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-14 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными обесцвечивающимися секторами на листьях. |
Variegated-15 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-17 1967 |
Условия обработки НММ как для линии Variegated-6 |
Внеядерная хлорофильная химера с белыми и светло-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-20 1971 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 150С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 150С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-23 1971 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 250С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми и желто-зелеными секторами на листьях. |
Variegated-24 1975 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 9:1; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 250 С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-25 1975 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 9:1; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 250С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-27 1975 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; семянки отмывали от НММ и дополнительно обрабатывали без доступа воздуха 2,4-динитрофенолом 10-5 М в течение 4 ч.; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 250С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-28 1975 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; семянки отмывали от НММ и дополнительно обрабатывали без доступа воздуха рифампицином, 0,015% в течение 4 ч.; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 250С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-29 1975 |
Условия обработки как для линии Variegated-28 |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-30 1977 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 150С в аэробных условиях; посев в поле через 14 суток хранения семянок при 150 С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-32 1977 |
Условия обработки как для линии Variegated-30 |
Внеядерная хлорофильная химера с белыми секторами на листьях. |
Variegated-33 1977 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 150С в аэробных условиях; посев в поле через 10 суток хранения семянок при 150С и 5 суток при 250С после обработки. |
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми секторами на листьях. |
Variegated-35 1978 |
0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч при 250С в анаэробных условиях; семянки отмывали от НММ и проращивали на воде 6 ч при 250С; посев в поле через 12 суток подсушивания и хранения семянок при 250С. |
Внеядерная хлорофильная химера с белыми секторами на листьях. |
Литература
- Бейли Н. Статистические методы в биологии. // М.: Мир. — 1973. — 271с. Белецкий Ю. Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. // Ростов н/Д: РГУ. — 1989. — 80 с.
- Гавриленко В. Ф., Ладыгина М. Е., Хандобина Л. М. Большой практикум по физиологии растений. // М.: Высшая школа. — 1975. — 392с.
- Гуськов Е. П., Маркин Н. В., Усатов А. В., Машкина Е. В. Модификация действия нирозометилмочевины на проростки подсолнечника тепловым шоком // Генетика. — 2001. — Т. 37. — С. 336–343.
- Давыденко О. Г. Нехромосомные мутации. // Минск: Наука и техника. — 1984. — 164 с.
- Усатов А. В, Разорителева Е. К., Машкина Е. В., Улитчева И. И. Спонтанные и индуцированные нитрозометилмочевиной реверсии пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника Helianthus annuus // Генетика. — 2004. — Т. 40. — С. 248–255.
- Усатов А. В., Рассадина В. В., Аверина Н. Г. и др. Структурно-функциональные особенности мутантных пластид внеядерных пестролистных форм подсолнечника // Физиология растений. — 2004. — Т. 53.- С. 175–183.
- Усатов А. В., Таран С Ф., Гуськов Е. П. Зависимость пластидного мутагенеза, индуцированного N-нитрозо-N-метилмочевиной, от возраста прорастающих семянок подсолнечника в момент обработки // Генетика. — 1995. — Т. 31. — С. 222–227.
- Усатов А. В., Федоренко Г. М., Устенко А. А. и др. Нехромосомные мутации подсолнечника. // Ростов н/Д: ЮФУ. — 2010. — 264 с.
- Хохлов С. С. Апомиксис: классификация и распространение у покрытосеменных // Успехи соврем. генетики. М.: Наука. — 1967. — Т. 1. — С. 43–105.