Решение о регистрации выдано: Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций. ЭЛ № ФС 77 - 68501, от 27 января 2017.
Live and bio-abiotic systems
ISSN 2308-9709 (Online)
Научное электронное периодическое издание
Южного федерального университета

Изменение уровней УФ-индуцированного мутагенеза при комбинации мутаций по генам, кодирующим белки-модификаторы хроматина, с мутацией rad54 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

УДК:
DOI: 10.18522/2308-9709-2015-11-4
58
Гены DOT1, HSM6 и ASF1 кодируют ключевые белки-модификаторы хроматиновой структуры. Нами изучено влияние комбинации мутаций dot1, hsm6 и asf1 с мутацией rad54. Показано, что в двойных мутантах dot1rad54, hsm6rad54 и asf1rad54 наблюдается резкое повышение уровня мутирования под действием УФ лучей. Комбинации указанных мутаций приводят также к изменению выживаемости клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae при облучении УФ.  

Ключевые слова: дрожжи, мутагенез, хроматин, модификаторы

The levels of UV-induced mutagenesis change in case of mutations in chromatin-remodeling proteins encoding genes are combined with the rad54 mutation in yeast Saccharomyces cerevisiae Yeast Saccharomyces cerevisiae DOT1, HSM6 and ASF1 genes encode crucial protein chromatin modifiers. We studied the effects of combining dot1, hsm6 and asf1 mutations with rad54 mutation. It’s demonstrated that the enormous increase of UV-induced mutagenesis is representative for dot1rad54, hsm6rad54 and asf1rad54 double mutants. Simultaneously the levels of survival of these double mutants change under the UV light action.

Keywords: yeast, mutagenesis, chromatin, modifiers

Введение 

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae белок Rad52 является ключевым в процессе проведения репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинационной репарации (ГРР) [9]. Белок Rad54 индуцируется в ответ на ДНР ДНК, но привлекается на более поздних стадиях ГРР, чем Rad52p. Мутанты по гену RAD54 отличаются повышенной чувствительностью к летальному действию гамма-лучей и ультрафиолета (УФ) [9, 11]. 

Ранее нами установлено, что частоты спонтанного мутирования изменяются при комбинациях мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad52 [6]. Как показано в наших предыдущих работах, продукт гена HSM3 принимает участие в стабилизации основного интермедиата пострепликативной репарации (ПРР) и ГРР — D-петли [4, 5].

Ген HSM6 идентичен гену PSY4 [3]. Мутации в этом гене влияют на мутационный процесс примерно так же, как и мутации hsm3. Белок Psy4 входит в состав трехсубъединичного фосфатазного комплекса Pph3—Psy2—Psy4, биохимическая функция которого состоит в дефосфорилировании гистона γН2А [3]. При этом никаких изменений в частотах спонтанного мутирования при комбинации мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad54 выявлено не было.

Ген DOT1 дрожжей S. cerevisiae кодирует гистон-метилазу, принимающую участие в модификации структуры хроматина в процессе чекпойнта, а также при репарации ДНР ДНК [8, 13].

Ген ASF1 кодирует белок Asf1, отвечающий за сборку-разборку нуклеосом и структуры хроматина, а также способный влиять на уровень пула дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) в клетке [10, 14]. Мутанты asf1 характеризуются замедленным ростом и повышенной чувствительностью к летальному действию ряда мутагенов [10].

В данной работе мы показали, что наблюдается изменение уровней УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости при комбинации мутаций hsm6, dot1 и asf1 с мутацией rad54.

Материалы и методы

Штаммы

Генотипы штаммов S. cerevisiae, использованных в работе, приведены в таблице 1. Одиночные мутанты (нуль-аллели) rad52, rad54, dot1, asf1 были получены замещением соответствующих генов в штамме дикого типа (2D-3034) при помощи вставки маркерных генов ауксотрофных потребностей, а также генетициновой (GEN) и NAT-кассет, в рамки считывания исходных генов в штамме дикого типа (см. Таблицу). Одиночный мутант hsm6 происходит из генетической коллекции лаборатории. Двойные мутанты dot1rad52, dot1rad54, hsm6rad52, hsm6rad54, asf1rad52 и asf1rad54 были получены делетированием геновRAD52 и RAD54, в указанных выше одиночных мутантах. Корректность вставок контролировалась при помощи ПЦР с использованием комбинаций двух внешних и/или внешнего и внутреннего праймеров для каждого из указанных генов, что позволяет контролировать фланги и замещение гена внутри рамки считывания.

Таблица 1 — Генотипы штаммов дрожжей, использованные в работе 

Штамм

Генотип

wt (2D-3034)

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1

rad52

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1rad52::URA3

rad54

MATαade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1rad54::LEU2

dot1

MATaade2Δ-248 leu2-3.112 ura3-160.188 trp1dot1::GENR

hsm6

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 hsm6-1

asf1

MATαade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 asf1::NAT

dot1rad52

MATαade2Δ-248 leu2-3.112 ura3-160.188 trp1dot1::GENR rad52::URA3

dot1rad54

MATαade2Δ-248 leu2-3.112 ura3-160.188 trp1dot1::GENR rad54::LEU2

hsm6rad52

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 hsm6-1 rad52::URA3

hsm6rad54

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 hsm6-1 rad54::LEU2

asf1rad52

MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 asf1::NAT rad52::URA3

asf1rad54

MATαade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188trp1 asf1::NAT rad54::LEU2

Среды

В работе использовались стандартные среды полного и минимального состава [1]. При работе с ауксотрофными мутантами в минимальную среду добавляли необходимые для роста метаболиты из расчета 20 мг/л для аминокислот и 3 мг/л для азотистых оснований. При учете частоты индуцированных мутаций по пяти ADE локусам использовалась среда со спиртом, состав которой описан ранее в [2].

Мутационные тесты

Источником УФ-лучей служила лампа БУФ-30П с мощностью дозы 1, 4 Дж/м2сек. Чувствительность к летальному действию УФ лучей определяли, снимая кривые выживаемости в зависимости от дозы [2]. Чувствительность к мутагенному действию УФ лучей определяли по индукции прямых мутаций в пяти ADE локусах (ADE4—ADE8) [12]. Было поставлено не менее 4—5 повторностей каждого опыта, на графиках приведены средние значения частот с 95 % доверительными интервалами.

Результаты и обсуждение

Нами проведены тесты чувствительности одиночных (штамм дикого типа (wt), rad52, rad54, hsm6, dot1, asf1) и двойных (dot1rad52, dot1rad54, hsm6rad52, hsm6rad54, asf1rad52 и asf1rad54) мутантов к летальному и мутагенному действию УФ лучей.

На рисунке 1 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, dot1, dot1rad52, dot1rad54. Как видно из рисунка 1, одиночные мутанты rad52, rad54, и dot1 и двойной мутант dot1rad52 отличаются по уровню УФ-индуцированного мутагенеза незначительно от штамма дикого типа (wt). При этом выживаемость одиночного мутанта dot1 снижена по сравнению с wt при средних дозах облучения. Двойной мутант dot1rad54 по чувствительности к летальному действию УФ лучей статистически не отличается от одиночных родительских мутантов dot1 и rad54, однако уровень мутагенеза, индуцированного УФ, отличается от штамма дикого типа в 15—20 раз, и в 7—8 раз от одиночных родительских мутантов.

 

На рисунке 2 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, hsm6, hsm6rad52, hsm6rad54. Как видно из рисунка 2, одиночные мутанты hsm6, rad52 и rad54 статистически близки по уровню УФ-индуцированного мутагенеза и отличаются от штамма дикого типа в 2 раза. При этом двойной мутант hsm6rad52 по уровню мутагенеза, индуцированного УФ лучами, отличается в 3—4 раза от контрольного штамма wt и в 2—2, 5 раза от одиночных родительских мутантов hsm6 иrad52. Двойной мутант hsm6rad54 показал значительное увеличение уровня УФ-индуцированного мутагенеза (5—6 раз по сравнению со штаммом дикого типа и 3—4 раза по сравнению с родительскими штаммами), более чем 10-кратное падение выживаемости по сравнению с контрольным штаммом и более чем 5-кратное по сравнению с исходными одиночными мутантами.

   

На рисунке 3 представлены графики УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости для штаммов wt, rad52, rad54, asf1, asf1rad52, asf1rad54. Как видно из рисунка 3, одиночный мутант asf1 отличается от контрольного штамма сниженной жизнеспособностью при средних и больших дозах облучения УФ (в 8—10 раз). При этом обладает повышенным уровнем УФ-индуцированного мутагенеза (в 7—8 раз выше, чем у штамма дикого типа). Летальность также сильно повышена у двойного мутанта asf1rad54: более чем в 10—12 раз по сравнению со штаммом wt, и более чем в 3—5 раз по сравнению с одиночными мутантами asf1 и rad54. Указанный двойной мутант характеризуется также сверхвысоким мутагенезом (при всех дозах УФ): уровень мутаций в 8—10 раз выше, чем у штамма дикого типа. Следует отметить, что частоты индуцированных мутаций у двойного мутанта asf1rad52 статистически близки к таковым у одиночного мутанта asf1.

 

Большинство жизненно важных процессов, связанных с ДНК, таких как транскрипция, репликация, рекомбинация и репарация, включают в себя изменения структуры ДНК и организации хроматина. Гистоновые белки образуют кор хроматина, и их пост-трансляционные модификации критичны для регуляции различных матричных процессов, таких как репарация и мутагенез.

Метилирование гистона Н3 является одним из ключевых событий в регуляции репарационных процессов у дрожжей. Одной из таких модификаций является метилирование белком Dot1 лизина 79 (К79) гистона Н3 [8]. В течение роста клеток дрожжей около 90 % нуклеосом содержат метилированный остаток Н3—К79. Штаммы дрожжей, делетированные по гену DOT1, или штаммы, в которых К79 заменен на другую аминокислоту, показывают ярко выраженную радиочувствительность [8, 13]. Монометилирование К79 не индуцируется в ответ на повреждения ДНК, хотя необходимо для ускорения репарационного процесса [13]. Мутация dot1 приводит к увеличенному мутагенезу, индуцированному метилметансульфонатом (ММС), что свидетельствует о том, что Dot1 негативно регулирует мутагенный путь обхода повреждений ДНК. Мутант dot1 более устойчив, чем дикий тип, к высоким дозам ММС. Белок Dot1 требуется также для мейотического и митотического рекомбинационного чекпойнта [8].

Анализ эпистатического взаимодействия гена DOT1 с ключевым геном RAD52, контролирующим ГРР, показал, что УФ чувствительность мутанта dot1 определяется его влиянием на ГРР, так как оба мутанта dot1 и rad52 показали одинаковую чувствительность к мутагену (рисунок 1). Таким образом, наши данные подтверждают полученный ранее результат об участии гена DOT1 в контроле рекомбинационной репарации [8, 13]. В то же время, в случае взаимодействия мутаций dot1 и rad54 мы наблюдали резкое повышение уровня УФ-индуцированного мутагенеза. Известно, что ген RAD54 активируется после RAD52 в механизме ГРР, но, в основном, отвечает за репарацию ДНР ДНК, возникших при УФ облучении клеток [7, 9, 11]. Однако не так давно появились данные о том, что Rad54p является одним из модификаторов структуры хроматина: входит в семейство SWI/SNF транслоказ, изменяющих топологию хроматина в том числе и в случае репарации ДНР ДНК [11]. Мы предполагаем, что изменение шаблона метилирования гистона H3 (при выключении DOT1) и частичная блокировка репарации ДНР по механизму ГРР (при выключении RAD54) приводят к усилению роли ошибочного пути ГРР, что, с одной стороны, повышает выживаемость клеток (большее количество повреждений ДНК репарируется ошибочным синтезом через повреждения), а с другой, как результат, — ведет к сильному росту индуцированного мутагенеза. Такой характер зависимости инактивации клеток может отражать дефект пострепликативной репарации в мутанте dot1, действие которой наиболее выражено у непочкующихся клеток (начальный участок кривой на рисунке 1). В то же время в почкующихся клетках потеря активности пострепликативной репарации компенсируется активацией рекомбинационной репарации.

Ранее нами показано, что ген HSM6 принимает участие в контроле мутационного процесса у дрожжей S. cerevisiae. Мутации вуказанном гене приводят к увеличению скорости спонтанного мутирования, обусловленного репарационным синтезом ДНК. Также наблюдалось увеличение частот мутагенеза, индуцированного различными ДНК повреждающими агентами. Делеция гена RAD52 также увеличивает темпспонтанного мутирования. Комбинация мутаций в этих генах приводит к еще большему уровню спонтанного мутагенеза, что отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, которая значительно понижена и в одиночном мутанте rad52 [3, 6].

Мы ранее также показали, что ген HSM6 идентичен гену PSY4, белок Hsm6 (Psy4) работает в составе комплекса Pph3-Psy2-Psy4, дефосфорилирующего гистон  γН2А. То есть, Hsm6 также относится к белкам-модификаторам структуры хроматина: мутации hsm6/psy4 изменяют шаблон фосфорилирования-дефосфорилирования Rad53p и γН2А, что отражается на длительности чекпойнта и эффективности репарации ДНК [3].

В данной работе мы показали, что комбинация мутации hsm6 с мутациями rad52 и rad54 приводит к резкому снижению выживаемости (что согласуется с ранее полученными данными) и увеличению уровня индуцированного мутагенеза (рисунок 2). Таким образом, изменение шаблона дефосфорилирования (инактивацияHSM6) вкупе c нарушениями в работе системы ГРР (инактивация RAD52 и/или RAD54) имеет более тяжелые последствия для клетки, чем в предыдущем случае — комбинации мутаций dot1 и rad54.

Ген ASF1 кодирует один из основных факторов сборки нуклеосом, а также сборки-разборки хроматина, в том числе и в случаях чекпойнта и репарации поврежденной ДНК [10, 14]. Мутанты asf1 отличаются замедленной (в 2—4 раза) скоростью роста, повышенной чувствительностью к большинству физических и химических агентов, повреждающих ДНК [14]. Также известно, что Asf1p способен регулировать уровень пула дНТФ в клетке [10].

Наблюдаемая нами картина (рисунок 3) хорошо согласуется со сказанным выше: выживаемость одиночного мутанта asf1 сильно снижена по сравнению со штаммом дикого типа. Мы предполагаем, что Asf1p работает на пути ГРР совместно с Rad52p: из рисунка 3 видно, что частоты индуцированных мутаций у штаммов asf1 и  asf1rad52 статистически совпадают. В двойном мутанте asf1rad52 механизм ГРР полностью блокирован, и бреши в структуре ДНК будут заполняться с использованием ПРР, эффективность которой ухудшена из-за снижения концентрации дНТФ, обусловленного мутацией asf1. При этом время, отводимое на каждый акт репарации, значительно повысится из-за задержки чекпойнта, и будет наблюдаться повышение уровня, как выживаемости, так и УФ-индуцированного мутагенеза. В случае двойного мутанта asf1rad54 снижение выживаемости и увеличение уровня мутирования объясняется переключением на склонный к ошибкам путь ГРР.

Выводы

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что комбинации мутаций основных генов, кодирующим белки-модификаторы хроматиновой структуры — dot1, hsm6 и asf1, с мутацией rad54 приводят к резкому повышению уровня УФ-индуцированного мутагенеза вследствие переключения механизма репарации на ошибочный путь гомологичной рекомбинационной и пострепликативной ветвей, а также снижению выживаемости (в случае двойных мутантов hsm6rad54 и asf1rad54) и изменению времени чекпойнта (мутанты asf1 и asf1rad52). Причем, чем более широкое системное действие имеет модификатор хроматина, тем сильнее для клетки последствия комбинации мутаций в нем с мутацией rad54.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ: проект №12-04-01467-а.

Литература

  1. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов // Л. Наука. 1984. 144 с.
  2. Ковальцова С.В., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomycescerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1 // 1996. Генетика. Т.32(3). с.366—372.
  3. Федоров Д.В., Ковальцова С.В., Евстюхина Т.А., Пешехонов В.Т., Черненков А.Ю., Королев В.Г. // Ген HSM6 идентичен гену PSY4 дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2013. Генетика. Т.49(3). с.328—336.
  4. Черненков А.Ю., Грачева Л.М., Евстюхина Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Федорова И.В.,  Королев В.Г. // Взаимодействие гена HSM3с генами эпистатической группы RAD6 у дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2012. Генетика. Т.48(2). с.160—167.
  5. Черненков А.Ю., Федоров Д.В., Грачева Л.М., Евстюхина Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Федорова И.В., Королев В.Г. // Взаимодействие гена HSM3 с генами, инициирующими гомологичную рекомбинационную репарацию у дрожжей  Saccharomycescerevisiae // 2012. Генетика. Т.48(3). с. 333—339.
  6. Черненков А.Ю., Федоров Д.В., Косарева А.А., Кожина Т.Н., Королев В.Г. // Изменение частот спонтанного мутагенеза при комбинациях мутаций hsm3 и hsm6 с мутацией rad52 в клетках дрожжей Saccharomycescerevisiae // 2014. Генетика. Т.50(2). с.243—245.
  7. Alexeev A., Mazin A., Kowalczykowski S.C. Rad54 protein possesses chromatin-remodeling activity stimulated by the Rad51-ssDNA nucleoprotein filament // 2003. Nat. Struct. Biol. 10(3):182—6
  8. Chaudhuri S., Wyrick J.J., Smerdon M.J. Histone H3 Lys79 methylation is required for efficient nucleotide excision repair in a silenced locus of Saccharomyces cerevisiae // 2009. Nucl. Ac. Res. V.37. p.1690—1700.
  9. Cole G.M., Schild M., Lowett S.T., Mortimer R.K. Regulation of RAD54- and RAD52-lacZ gene fusions in Saccharomyces cerevisiae in response to DNA damage //  1987. Mol. Cell. Biol. V.19877. Iss.3. p.1078—1084.
  10. Kats E.S., Albuquerque C.P., Zhou H., Kolodner R.D. Checkpoint functions are required for normal S-phase progression in Saccharomyces cerevisiae RCAF- and CAF-I-defective mutants // 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(10):3710—5
  11. Petukhova G., van Komen S., Vergano S., Klein H., Sung P. Yeast Rad54 promotes Rad51-dependent homologous DNA pairing via ATP hydrolysis-driven change in DNA double helix conformation // 1999. J. Biol. Chem. 274(41):29453—62
  12. Roman H. A system selective for mutations affecting the synthesis of adenine in yeast // 1956. Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. Ser. Physiol. V.26. p.299—314.
  13. vanLeeuwen F., Gafken P.R., Gottschling D.E. Dot1p modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core // 2002. Cell. V.109. p.745—756.
  14. Yamaki M., Umehara T., Chimura T., Horikoshi M. Cell death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae mediated by deletion of the histone chaperone ASF1 // 2001. Genes Cells 6(12):1043—54.

Literature

  1. Zaxarov I.A., Kozhin S.A., Kozhina T.N., Fedorova I.V. Sbornik metodik po genetike drozhzhej-saxaromicetov // L. Nauka. 1984. 144 s.
  2. Koval'cova S.V., Korolev V.G. Shtamm drozhzhej Saccharomyces cerevisiae dlya testirovaniya mutagenov okruzhayushhej sredy, osnovannyj na vzaimodejstvii mutacij rad2 i him1 // 1996. Genetika. T.32(3). s.366—372.
  3. Fedorov D.V., Koval'cova S.V., Evstyuxina T.A., Peshexonov V.T., Chernenkov A.Yu., Korolev V.G. // Gen HSM6 identichen genu PSY4 drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2013. Genetika. T.49(3). s.328—336.
  4. Chernenkov A.Yu., Gracheva L.M., Evstyuxina T.A., Koval'cova S.V., Peshexonov V.T., Fedorova I.V.,  Korolev V.G. // Vzaimodejstvie gena HSM3 s genami e'pistaticheskoj gruppy RAD6 u drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2012. Genetika. T.48(2). s.160—167.
  5. Chernenkov A.Yu., Fedorov D.V., Gracheva L.M., Evstyuxina T.A., Koval'cova S.V., Peshexonov V.T., Fedorova I.V., Korolyov V.G. // Vzaimodejstvie gena HSM3 s genami, iniciiruyushhimi gomologichnuyu rekombinacionnuyu reparaciyu u drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2012. Genetika. T.48(3). s. 333—339.
  6. Chernenkov A.Yu., Fedorov D.V., Kosareva A.A., Kozhina T.N., Korolev V.G. // Izmenenie chastot spontannogo mutageneza pri kombinaciyax mutacij hsm3 i hsm6 s mutaciejrad52 v kletkax drozhzhej Saccharomyces cerevisiae // 2014. Genetika. T.50(2). s.243—245.