Изучение аллельного состояния микросателлитных локусов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)

Введение

Современные сорта и гибриды сахарной свеклы на основе цитоплазматической мужской стерильности обеспечивают высокие урожайность и сбор сахара. Для успешной селекционной работы необходим скрининг имеющихся генетических ресурсов и изучение их изменчивости.

В мировой практике для изучения особенностей генома близкородственных форм, которыми являются сорта и линии культурных растений, используют методы молекулярного маркирования на основе микросателлитных (МС) локусов. Большинство идентифицированных МС-локусов являются вариабельными по длине, что обусловлено различным количеством тандемных последовательностей. Анализ длины микросателлитов, как правило, позволяет выявить значительное количество аллельных вариантов, а их распространение по всему геному позволяет охватить значительную его часть. В последние годы, проведен ряд исследований, посвященных поиску вариабельных по длине МС-последовательностей в геноме сахарной свеклы, а также разработаны маркёры, позволяющие исследовать их аллельное состояние, в частности, маркёры серии GZM [5, 6].

Цель исследования

Целью исследования является установление межвидового полиморфизма МС-локуса с использованием маркёра GZM 086 у сортов и гибридов сахарной свеклы украинской и зарубежной селекции.

Материал и методы

В исследованиях использовали сорта сахарной свеклы Белоцерковская односемянная 45, Ялтушковская односемянная 64, диплоидные гибриды на мужскостерильной основе Катюша, Атаманша, Иваново-Веселоподольский МС 84, Уладово-Верхнячский МС 37, Ялтушковский МС 72, Ивановский МС 33, Украинский МС 72, Украинский МС 70 и триплоидные — Александрия, Белоцерковский МС 57, которые внесены в Государственный реестр сортов растений Украины. Работа была выполнена с использованием лабораторного метода для определения молекулярно-генетического полиморфизма с помощью SSR-анализа; математически-статистического — для оценки результатов исследований, расчетно-сравнительного — для установления аллельного состояния микросателлитных локусов.

Для исследования полиморфизма между генотипами сахарной свеклы ДНК выделяли из проростков, полученных по общепринятой методике [1]. Выборка в пределах каждого исследованного сорта состояла из тридцати образцов. ДНК экстрагировали с использованием катионного детергента ЦТАБ [2, 4]. Измерение концентрации и чистоты ДНК проводили спектрофотометрическим методом, который основан на отношении длин волн при максимальной фотометрической абсорбции нуклеиновых кислот при 260 нм и 280 нм [2]. Для изучения молекулярно-генетического полиморфизма использовали маркёр GZM 086, с известной хромосомной локализацией и структурой микросателлитного повтора, с описанием аллельного состава для культурной свеклы европейского происхождения [5, 6].

Реакцию амплификации проводили при таких температурных условиях: начальная денатурация при 94 °С 3 мин., денатурация при 93 °С 0,5 мин., гибридизация при 55 °С 0,5 мин. и элонгация при 72 °С 1 мин., 33 цикла. Основные структурные характеристики и оптимальная температура гибридизации праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Характеристика праймеров для МС-локуса GZM 086 сахарной свеклы

Согласно литературным данным, исследуемый МС-локус имеет 7 аллелей размером 162—210 п.н. с локализацией на III хромосоме и структуре повтора (GA)_n/ (GTGA)_n [5].

После окончания ПЦР полученные продукты реакции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле при разности потенциалов 2—6 W течение 2,5—4 ч., затем визуализировали при ультрафиолетовом освещении с длиной волны в диапазоне 254—310 нм [4]. Размер аллелей рассчитывали в парах нуклеотидов с помощью компьютерной программы TotalLab v. 2.01.

По матрице присутствия/отсутствия аллелей в локусе для данных SSR-анализа рассчитывали генетическое подобие между исследуемыми образцами по формуле: NL_xy=2n₁₁/(2n₁₁+n₀₁+n₁₀), где n₁₁ — количество локусов с наличием общих аллелей, n₀₁ и n₁₀ — количество локусов с различными аллелями. Генетические дистанции определяли по формуле: D = ?lnNL_xy, где NL_xy — генетическое подобие.

Распределение генотипов согласно генетическим дистанциям осуществляли с помощью кластерного анализа. Группирование исследуемых образцов в классы проводили с помощью невзвешенного метода средних связей, согласно которому критерием для установления степени близости является среднее значение показателей генетической близости между членами кластера и кандидатом на включение в кластер [3].

Для характеристики генетической структуры исследуемых генотипов сахарной свеклы рассчитывали частоты детектированных аллелей, которые отражают их относительное количество в исследуемой выборке по формуле: p=n/N, где n — количество образцов с наличием некоторого аллеля, N — общее количество образцов.

Одним из критериев, характеризующим степень идентифицированной изменчивости в популяции, и, соответственно, способность маркёра определять разницу между генотипами, является индекс полиморфности локуса. Этот показатель рассчитывали по формуле: PIC=1?∑p_lu², где PIC — индекс полиморфности локуса, p_lu — частота u-того алеля для l локуса. Расчеты проводили с помощью компьютерных программ Excel, Statistica 6.0 [3, 4].

Результаты и обсуждение

Особенности выделения ДНК из растительного материала свеклы обусловлены характером ее биохимического состава и относительно малым размером генома. Поэтому, для выделения ДНК из проростков сахарной свеклы использовали метод экстракции с помощью ЦТАБ реагента, который позволяет минимизировать потери ДНК при экстракции. Для проведения реакции амплификации концентрация ДНК должна иметь значения не менее 150—200 мкг/мл и степень очистки — 1,8—1,9 при отношении длины волн 260/280 нм [2]. Результаты измерения представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Концентрация и чистота образцов полученной ДНК

Из представленных данных можно видеть, что концентрация ДНК исследуемых образцов находилась в пределах 169,6—374,8 мкг/мл, значение чистоты 1,72—2,02.

Количество и качество выделенной ДНК свидетельствует о том, что выбранная методика выделения ДНК позволяет получить высокоочищенную ДНК с концентрацией не менее 150 мкг/мл, которую можно использовать для проведения ПЦР. На рис. 1 представлены аллели, полученные для 9-ти сортов сахарной свеклы с использованием маркёра GZM 086.

Рисунок 1 — Электрофоретическое распределение аллелей согласно маркёру GZM 086 для 12 генотипов сахарной свеклы: 1 — Катюша; 2 — Атаманша; 3 — Иваново-Веселоподольский МС 84; 4 — Уладово-Верхнячский МС 37; 5 — Александрия; 6 — Белоцерковский МС 57; 7 — Белоцерковская односемянная 45; 8 — Ялтушковская МС 72; 9 — Ялтушковская односемянная 64; 10 — Ивановский МС 33; 11 — Украинский МС 72; 12 — Украинский МС 70; 13 — маркёр молекулярного веса 100bp

В результате электрофоретического разделения продуктов амплификации, полиморфизм аллелей идентифицирован у сортов Белоцерковская односемянная 45, Ялтушковская односемянная 64, а также у гибридов Украинский МС 72, Белоцерковский МС 57, Уладово-Верхнячский МС 37 и Катюша. На треках 2, 3, 10 представлены неполиморфные аллели исследуемых гибридов сахарной свеклы (Атаманша, Иваново-Веселоподольский МС 84 и Ивановский МС 33), они имеют в своем составе по одному виду аллеля. Для гибридов Александрия, Ялтушковский МС 72 и Украинский МС 70 согласно маркёру GZM 086 не обнаружено ни одного аллеля. В итоге, был исследован полиморфизм 12 генотипов сахарной свеклы и установлено, что полиморфными из них являются 2 сорта и 4 гибрида.

Для расчета размера аллелей МС-локуса полученные электрофоретические спектры анализировали с помощью компьютерной программы TotalLab v. 2.01. В целом, по маркёру GZM 086 выявлены и проанализированы пять аллелей размерами: 157; 177; 192; 202; 210 п.н., значение индекса полиморфности локуса составляло 0,62. Величина индекса полиморфности зависит от количества выявленных аллелей и их частот, а именно чем равномернее представлены аллели в выборке, тем выше будет индекс [5, 6]. Идентифицированные аллели МС-локуса равномерно представлены в выборке, что позволило получить высокое значение индекса полиморфности локуса (рисунок 2).

Рисунок 2 — Частоты аллелей выявленных у сортов сахарной свеклы по маркёру GZM 086

Таким образом, согласно результатам исследования молекулярно-генетического полиморфизма 12 генотипов сахарной свеклы отечественной и иностранной селекции был установлен качественный и количественный аллельный состав МС-локуса GZM 086.

Используя данные аллельного состава МС-локуса сортов сахарной свеклы, была построена матрица, в которой отмечали присутствие/отсутствие аллелей — соответственно 1/0. На основе матрицы была проведена оценка генетического сходства исследуемых генотипов с помощью кластерного анализа. В соответствии с полученным распределением, сорта и гибриды были объединены в два кластера (рисунок 3).

Рисунок 3 — Дендрограмма сортов сахарной свеклы

В результате анализа выявленного молекулярно-генетического полиморфизма, было установлено наличие двух генетически отдаленных групп для сортов и гибридов сахарной свеклы. Согласно полученным данным, в первый кластер вошли гибриды Иваново-Веселоподольский МС 84 и Ивановский МС 33, что указывает их на генетическое сходство по исследуемому локусу. Также, близкими к указанным гибридам являются Александрия, Ялтушковский МС 72, Украинский МС 70, Катюша и Атаманша. Однако, следует отметить, что гибриды Александрия, Ялтушковский МС 72 и Украинский МС 70 формируют отдельный кластер, поскольку по исследованному МС-локусу не обнаружено ни одного аллеля. Ко второму кластеру, согласно полученной дендрограмме, относятся гибриды Уладово-Верхнячский МС 37 и Белоцерковский МС 57, к ним прилегают сорт Белоцерковская односемянная 45 и гибрид Украинский МС 72. Отдельно от указанных кластеров, выделенный сорт Ялтушковская односемянная 64, который не принадлежит ни к одному кластеру.

Выводы

В результате исследования молекулярно-генетического полиморфизма сортов и гибридов сахарной свеклы по маркёру GZM 086, полиморфными оказались 2 сорта и 4 гибрида, что составило 0,67 %. По указанному МС-локусу проанализированы пять аллелей, значение индекса полиморфности локуса составило 0,62, что свидетельствует о том, что идентифицированные аллели равномерно представлены в выборке. Установлено, что для определения внутривидового полиморфизма сортов и гибридов сахарной свеклы можно рекомендовать изучение аллельного состояния по маркёру GZM 086 в комплексе с другими SSR-маркёрами.

Литература

1. ДСТУ 3226–95 (ГОСТ 10882–98) Семена односемянной сахарной свеклы. Посевные качества. Технические условия. — Держстандарт України. — Київ. — 1999. — 16 с.
2. Великов В. А. Молекулярная биология. Практическое руководство / Великов В. А. — Саратов: Издательство «Саратовский источник», 2013. — 84 с.
3. Ерматраут Е. Р. Статистичний аналіз агрономічних дослідних даних в пакеті STATISTICA 6.0 / Е. Р. Ерматраут, О. І. Присяжнюк, І. Л. Шевченко. — К.: ТОВ «ПоліграфКонсалтинг», 2007. — 56 с.
4. Роїк М. В. Визначення молекулярно-генетичного поліморфізму роду BETA L. за допомогою полімеразної ланцюгової реакції / Роїк М. В., Сиволап Ю. М., Петюх Г. П., Шаюк Л. В., Баб’яж А. І., Білоус Н. В. — 2007. — 27 с.
5. Dörnte J. Entwicklung, Charakterisierung und Kartierungvon Mikrosatellitenmarkern bei der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.): Dissertation Doktors der Agrarwissenschaften / Dörnte J. — Gatersleben, 22.10.2001. — 100 p.
6. Smulders M. J. M. Characterisation of sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) varieties using microsatellite markers / M. J. M. Smulders, G. D. Esselink, I. Everaert, J. De Riek, B. Vosman / ВМС Genetics. — 2010. — Vol. 11(41). — P. 1—11.